Инсулин: полусинтетический метод получения

Получение инсулина: все основные способы

Инсулин представляет собой вещество, которое образуется в поджелудочной железе («островки Лангерганса»). Этот гормон имеет ключевое значение в обмене веществ практически в любых тканях организма, так как обеспечивает открытость клеточных мембран для компонентов глюкозы. Пока получение инсулина не было налажено синтетическим способом, многие пациенты с сахарным диабетом были обречены на гибель, так как глюкоза используется для производства всех видов молекул, содержащих углерод, и представляет собой единственный источник энергии для митохондрий. При отсутствии инсулина мембрана клетки пропускает ничтожное количество глюкозы, что ведет к смерти клеток от недостатка питания.

Абсолютная и относительная недостаточность инсулина

Диабет, как нам известно, бывает двух типов. Первый тип возникает тогда, когда у человека присутствует деструкция в бета-клетках вышеупомянутых «островков Лангерганса». Это абсолютная недостаточность инсулина. Диабет же второго типа развивается при относительной инсулиновой недостаточности — некорректном воздействии инсулина на тот или иной вид ткани. О том, что уровень сахара в крови регулируется каким-то гормоном в поджелудочной железе, сделал предположение еще русский врач И.М. Соболев в середине 19 века. Несколько позже П. Лангерганс установил, что в железе имеются какие-то особые участки, а О. Минковский и Д. Меринг установили связь именно между этими «островками» и уровнем сахара в крови в ходе опытов на собаках. Около 20 лет ушло на то, чтобы извлечь из «островков Лангерганса» то, что они производят и попытки ввести полученные вещества в виде водных растворов тем же собакам. Нужно сказать, что опыты излечения диабетических состояний у четвероногих друзей увенчались успехом к 1916 году, но их развитие прервала Первая мировая война (работы Н. Паулеску).

В ходе же опытов Ф. Бантинга на собаках животным таким образом оперировалась поджелудочная железа, что большая часть ее вырождалась, оставляя только участки с клетками Лангерганса. После ряда опытов Бантинг решил взять для приготовления экстрактов эмбриональную поджелудочную железу теленка, которая еще не содержала пищеварительные железы, и полученное вещество было испытано на 14-летнем Л. Томпсоне, который получил тяжелую аллергическую реакцию из-за побочных компонентов. Очистить от примесей взялся Д. Коллип, в результате чего был выделен первый инсулин, который вернул из комы десятилетнего мальчика. Схожим образом инсулин получают сегодня еще в некоторых странах из поджелудочных желез крупного рогатого скота (бычий) или свиней. Из 1 кг вещества можно извлечь 0,1 г инсулина.

Технологии прошлого века

Для производства измельченное (часто замороженное) исходное сырье подвергают кислотно-спиртовой экстракции (двухстадийная обработка подкисленным этиловым спиртом), после чего результаты химической реакции нейтрализуют и подвергают процедуре высаливания — выделения из раствора путем добавления другого вещества, чаще солей цинка. Раствор кристаллизуют и высушивают. Экстракт после таких манипуляций содержит около 90% инсулина. Остальные доли занимают дополнительные вещества:

• полипептид панкреатический;
• глюкагон;
• проинсулин;
• соматостатин.

Эти элементы делают получаемый препарат иммуногенным, то есть организм человека вырабатывает антитела, вызывая аллергические реакции. Иммуногенность препарата базируется в основном на проинсулине, который представляет собой предшественник самого инсулина и содержит дополнительную молекулу (С-пептида), которая имеет различные модификации у разных живых существ.

Поэтому полученное вещество подвергали повторной обработке в виде растворения и рекристаллизации, что позволяло повысить содержание инсулина до уровня более 90% (стандартная степень очищения). Нужно сказать, что препарат, получаемый из поджелудочных желез копытных, менее подходит человеку, чем инсулин, экстрагированный из внутренностей свиньи. Сам по себе инсулин состоит из 51 аминокислоты, из которых у человека и копытных не совпадают 3 (сказывается, полагается, вегетарианский рацион быков), а у людей и, скорее, всеядной свиньи только одна аминокислота. Поэтому бычий инсулин (и его смеси со свиным) не назначаются больным сахарным диабетом на ранних этапах заболевания, беременным и при краткосрочной терапии (к примеру, послеоперационной). Он может вызвать самые разнообразные побочные реакции, вплоть до изменений подкожной жировой клетчатки в местах укола.

Монокомпонентный инсулин

Перед врачами и учеными после открытия инсулина встал вопрос о повышении степени его очистки для уменьшения аллергических реакций пациентов. Для этого вышеуказанный экстракт стандартной степени очистки направляют на хроматографию (чаще жидкостную) в ходе которой на стенках аппаратуры образуется монопиковый инсулин (в том числе монодезамино- моноагрегин- и моноэтилинсулины). Если полученное вещество подвергнуть хроматографии несколько раз, то получится монокомпонентный инсулин, который дает существенно меньше побочных эффектов, а также имеет высокую активность. Такие инсулины на флаконе обладают обычно маркировкой «МС».

Как получают инсулин в 21 веке? До сих пор не устарел вышеуказанный полусинтетический метод, когда исходное сырье проходит многие стадии очистки. Недостатком в данном случае является зависимость от поставок с животноводческих ферм. Два других способа — полный химический цикл или производство из поджелудочных желез людей не представляются возможными в связи с неэкономичностью, неэтичностью в отношении использования тканей человека. Поэтому с конца 20 века западные компании («Хехст», «Ново Нордиск», «Эли Лилли», «Авентис») освоили и запатентовали биосинтетическую технологию, базирующуюся на генной инженерии.

Роль кишечной палочки и дрожжей в генерации инсулина

Описание процесса получения инсулина через биологическое синтезирование выглядит в общих чертах примерно следующим образом: выделенный геном инсулина человека внедряется в геном кишечной палочки, которая быстро синтезирует проинсулин, от которого потом отщепляется фермент С-пептид (технология фирмы «Эли Лилли»). «Ново Нордиск» добывает гормон несколько по-другому. Здесь создали искусственный ген минипроинсулина, у которого есть С-пептидный «хвостик». Он значительно короче, чем у инсулина, требуемого для лекарства. Ген помещают в клетку пекарских дрожжей, которая делится, генерируя необходимые объемы сырья. После чего в полученном материале удаляют мини С-пептид и получают вещество с высокой степень очистки, идентичное инсулину людей.

Корпорация же «Авентис» берет за основу ген макаки, у которой инсулин совпадает с человеческим инсулином. Используя матричную рибонуклеиновую кислоту, получают клонирование ДНК от этого гена и внедряют в клетки кишечной палочки. Основной задачей производящих компаний является полная очистка готового продукта от примесей в виде следов деятельности микроорганизмов и остатков самих организмов. Современные методы контроля на производстве позволяют это сделать настолько эффективно, что биосинтетический инсулин является практически идентичным у основных мировых поставщиков.

Период действия препаратов

На заре своего появления инсулин имел достаточно короткий срок действия (начинал действовать через 15-40 мин, но «работал» не больше 1,5-4 часов), что привело к потребности создания пролонгированных лекарств. В их химический состав вошли протамин (белок, добывается из молоки рыбы, имеет щелочную реакцию), фосфатный буфер (поддержание нейтрального уровня рН) и цинк, а также фенол (креазон) для обеспечения процесса кристаллизации. В результате таких дополнений получился НПХ-инсулин.

x

https://www.youtube.com/watch?v=fZ1ouhhP7KE

После того как ученые выяснили, что добавление небольших объемов цинка в условиях нейтрального рН пролонгирует срок действия инсулина, был изобретен инсулин-цинк-суспензия (ИСЦ), первой лекарственной формой которого был инсулин «Ленте». Он и его последующие аналоги позволили получать лечебный эффект в 6-8 часов для инсулина промежуточного действия и в 8-10 часов — для длительного действия. Однако нужно помнить, что инсулин промежуточного и длительного действия начинает «работать» через 2 и 4 часа и действуют 6-8 и 8-10 часов соответственно.

Поэтому каждый больной диабетом должен обладать индивидуальной круглосуточной схемой приема инсулина.

x

http://youtu.be/LkCrbc50dks

Инсулин как готовый лекарственный препарат содержит также консерванты и дезинфицирующие вещества. Это крезон и фенол (если они есть, то лекарство неприятно пахнет), метилпарабен, ионы цинка. Каждая лекарственная форма содержит свой дезинфицирующий компонент. К примеру, в ИСЦ не вносят фенол, так как он меняет физические свойства инсулина (в ИСЦ применяют метил парабензоат). Кроме того, в препаратах есть ингредиенты, которые придают буферные свойства и переводят инсулин в кристаллическое состояние. Для ИСЦ это NaCl, для других лекарственных форм — фосфаты. Пациенты могут получать инсулин в разных формах, включая аэрозоль, раствор или суспензию. Лекарство может быть как рН нейтральным, так и кислым. Стандартными концентрациями выпуска являются: 500 едмл, 250, 100, 80 и 40.